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測序

  • 樣本制備篇--高通量核酸提取


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  • 樣本制備篇--FFPE核酸提取

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  • 樣本制備篇--樣本質控與定量

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  • 文庫構建篇--核酸片段化系統

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  • 文庫構建篇--核酸片段篩選回收系統

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  • 文庫構建篇—高效DNA建庫試劑盒



    NEBNext Ultra Ⅱ DNA 文庫構建產品

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    NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒能夠用更低起始量的 DNA 構建高質量的文庫。文庫制備每一個步驟中的試劑都經過優化,能夠從 500 pg 1 μg 的起始 DNA 高效構建高質量的文庫。新一代的 NEBNext 試劑采用了快速、流程化、自動化的工作流程,在降低 PCR 循環數的同時提高了 GC 覆蓋度。本試劑盒與 PCR-free 的工作流程兼容,且對于難以建庫的樣本,如 FFPE 樣本,也有很好的效果。

    優勢:

    更高的文庫產量,滿足您更多需求;

    即使在 DNA 樣本量非常低的情況下(低至 500 pg),依舊能夠產生高質量的文庫;

    適用于所有 DNA 樣本,包括富含 GC 的區域及 FFPE-DNA 樣本;

    提高靶向富集等應用的產量及質量;

    流程化的操作過程,操作時間大大減少,與自動化建庫設備兼容;試劑盒和模塊提供了極大的選擇靈活性。

    NEBNext Ultra II DNA建庫工作流程

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    NEBNext Ultra II DNA文庫試劑盒組成

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    A 以人 NA19240 基因組 DNA 為樣本制備文庫,起始量和 PCR 循環數如圖所示。文庫構建按照各生產商推薦方法進行,省略片段篩選的步驟。

    B 以人 NA19240 基因組 DNA 為樣本制備文庫,起始量和制備試劑盒如圖所示,文庫的構建按照生產商推薦的方法進行,不進行擴增步驟。接頭連接的分子用 qPCR 進行定量,定量的結果以 Ultra II 的轉化率為基準進行標準化處理。對于不同起始量 DNA Ultra II 試劑盒均能產生最高的接頭連接分子轉化效率。

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    500 pg1 ng 100 ng 的基因組 DNA 為起始樣本,使用 Ultra II DNA 文庫制備試劑盒進行建庫后使用 Illumina MiSeq? 測序。使用 Bowtie 2.2.4 Reads 進行比對并使用 Picard's Collect GC Bias

    Metrics (v1.117) 計算 GC 覆蓋度。預期的標準化覆蓋度 1.0 以灰色的水平線表示,不同 GC% 100 bp 區域的數量以灰色條形圖顯示。不同顏色的線形圖表示標準化后的文庫覆蓋度。

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    100 ng NA19240 基因組 DNA 為起始樣本構建文庫,文庫制備試劑盒如圖所示,文庫的構建按照生產商推薦的方法進行,不進行擴增步驟。文庫產量用 NEBNext 文庫定量試劑盒進行 qPCR 定量。使用NEBNext Ultra II 試劑盒得到的文庫產量最高。

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    100 ng NA19240 基因組 DNA 為起始樣本構建文庫,使用的文庫制備試劑盒如圖所示,文庫的構建按照生產商推薦的方法進行,不進行擴增步驟。文庫使用 Illumina NextSeq 500 進行測序。測序得到的

    Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比對到 GRCh37 參考基因組。數據顯示 NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒

    PCR-free 實驗流程中得到高質量的測序讀數,即使在起始量非常低的情況下。

     % Mapped: 比對到 GRCh37 參考基因組的百分比。

    % Duplication: 比對序列中重復的百分比。

    % Chimeras: 序列中超過最大插入片段或兩端比對到不同染色體上的百分比。

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    17-30 ng FFPE 組織樣本中提取的 DNA 為起始樣本制備文庫,組織來源如上表所示,擴增循環數為 10 個循環,用Illumina MiSeq 進行測序。

    測序得到的 Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比對到 GRCh37 參考基因組

    % Mapped: 比對到 GRCh37 參考基因組的百分比。

    Mapped in Pairs: mate pair 也能比對到參考基因組的百分比。
    % Duplication: 比對序列中重復的百分比。

    % Chimeras: 序列中超過最大插入片段或兩端比對到不同染色體上的百分比。

    數據顯示使用 NEBNext DNA 文庫制備試劑盒能夠獲得高質量的測序結果,即使是起始量非常低的 FFPE 樣本。

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    當使用 Nimblegen 進行靶向富集時,首先以 100 ng HG02922 基因組 DNA 為起始樣本,分別使用NEBNext Ultra II NEBNext 接頭引物,或 Kapa 文庫制備試劑盒 SeqCap接頭(Roche)。隨后的靶向富集使用 NimbleGen SeqCap Human Exome v3 試劑盒完成。

    當使用 Sureselect 進行靶向富集,首先以 200 ng HG02922 基因組 DNA 為起始樣本,分別使用

    NEBNext Ultra II NEBNext 接頭引物,Kapa 文庫制備試劑盒及 NEBNext 接頭引物,和 SureSelect Reagent KitIllumina (ILM) 平臺配合 Herculase? II Fusion DNA 聚合酶進行建庫。隨后的靶向富集使用 SureSelectHuman All Exon V6 試劑盒完成。

    實驗均按照生產商推薦的方法進行,包括推薦的 PCR 循環數及捕獲前和捕獲后處理。使用 NEBNext Ultra II 構建的文庫在兩種富集方法下均可獲得更高的捕獲后產量。

  • 文庫構建篇——高效RNA建庫試劑盒

    Even more from Less - NEBNext Ultra II RNA 文庫制備試劑盒

    您是否需要提高 RNA-seq 實驗的靈敏度與特異性?您是否遇到更低起始量樣本?為了解決這些挑戰,新一代的 RNA 文庫制備試劑盒中每一個步驟

    都經過優化,在更低起始量,更少循環數的條件下,依舊能夠得到數倍產量的高質量文庫。文庫制備試劑盒流程化,自動化的操作流程,適用于

    定向(鏈特異性文庫,使用“dUTP”方法(1,2))及非定向文庫制備,更有包含 SPRISelect? 磁珠的形式,方便片段篩選及純化步驟。

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    分別使用 NEBNext Ultra II RNA 定向文庫制備試劑盒 (搭配NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分離模塊),Kapa Stranded mRNA-SeqKit, Kapa mRNA HyperPrep Kit,Illumina TruSeq Stranded mRNA

    Kit將帶有 Poly(A) 尾的 mRNA 從 Human Universal Reference RNA(Agilent #740000) 中分離出來建庫。制備好的文庫在 Illumina NextSeq? 500 平臺用雙端模式 (2x76 bp) 測序。Reads 比對到hg19 參考基因組。每個文庫的 GC 含量分布使用比對上的reads 進行計算。NEBNext Ultra II 定向 RNA 文庫制備試劑盒制備的文庫在不同起始量條件下有均一的 GC 含量分布,而其他試劑盒 GC 含量分布會隨著不同起始量產生變化,顯示了起始量依賴序偏嗜性。

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                                 *以上內容來源于NEB(北京)

  • 三代測序篇--第三代單分子測序系統

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